HIV治疗的新策略—通过基因敲除产生抵抗HIV的细胞

点击数：13892014-07-28 12:32:25　来源: 上海美盛医疗器械有限公司

自从发现HIV病毒以来，研究人员一直在寻求预防HIV感染和治疗HIV的有效策略。经过几十年的努力后，目前研究人员把目光主要集中在三个领域：开发有效的疫苗，寻找毒性较低的抗病毒药物，还有就是本文要探讨的主要内容—通过修改宿主细胞的基因，使它们不能被病毒感染。从而到达治疗的目的。

该篇小型的评论性文章总结了该领域的临床研究结果，并展望了该方法的临床前景。文章发表在2014年7月9日的JAMA上。

至目前为止，疫苗和药物治疗功能性治愈HIV（患者不再需要服用药物）的能力有限。基因编辑这一技术可以帮助患者达到功能性治愈的目标。该技术主要针对免疫细胞表面的HIV特定受体，目前在实验室中已经成功，有些已经进入早期的临床试验。

1、已经进入临床试验的CCR5敲除法

图 HIV侵入宿主细胞需要CD4受体和辅助受体CCR5，抑制CCR5的表达可以功能性治愈HIV患者

当病毒侵入免疫系统的CD4 T细胞时，病毒必须需要至少2个受体，第一个为细胞表面的CD4糖蛋白，然后是2个辅助受体中的一个，CCR5或CXCR4。

约有1%的欧洲人可以抵抗HIV病毒，因为他们是CCR5基因突变的纯合子。该突变为CCR5-Δ32突变，它可以使CCR5这个小蛋白不再在细胞表面表达。

几年前，研究人员发现，一例柏林患者在接受CCR5-Δ32突变供体的骨髓移植后，其艾滋病和白血病都得到了治愈。因为很难找到CCR5-Δ32突变的骨髓移植捐助者，干细胞移植治疗尚不能大规模运用。

因此，研究人员一直致力于开发新的技术，并使其能在临床上大量运用。例如，通过病毒载体或其他方法干扰CCR5 RNA的产生。

通过抑制或消除CD4+T细胞表面的CCR5辅助受体的表达来达到CCR5 -Δ32突变的治疗效果，这是一个“古老”的想法。以前的主要问题是通过何种手段来实现CCR5消除或抑制。

研究人员曾试图利用CCR5胞内抗体（胞内抗体，一个特定的目标细胞内抗原）或小干扰RNA。但是这些方法的效果都不好。基因编辑技术的出现很好地解决了该问题。该方法通过核酸酶特异性地切除某一目的基因，从而使该基因的表达受阻。

南加州大学Paula Cannon博士及其团队已经使用这种核酸酶—锌指核酸酶在人类造血干细胞中敲除了CCR5基因。他们把敲除后的干细胞移植到一个“人源化”的小鼠模型（转基因小鼠具有人类的免疫系统）中，这些干细胞可以分化成多种血细胞，同时保留了CCR5缺失的特性。研究人员用HIV感染小鼠，病毒的复制受到抑制，人类T细胞保持在正常水平。

这种方法的一个优点是干细胞能不断分化出新的CD4阳性T细胞，从而有效抵抗病毒的感染，随着时间的推移，这些细胞存活下来，并逐渐主导，使宿主能到抵抗病毒感染。Paula Cannon博士及其团队正在对此进行临床试验。

June及其同事最近完成了一个使用相同方法的临床试验，但不是针对造血干细胞，而是自身CD4细胞。在该项研究中，12例慢性HIV感染者接受了一百亿个自体CD4细胞（11%-28%进行了CCR5基因敲除）。出现1例严重不良反应事件是由于输血反应。1周时，平均CD4细胞计数为1517/μL，是注射前（448次/μL）的3倍还多。

据估计，一周后外周血中8.8%的循环单核细胞和13.9%的CD4细胞为CCR5缺失的细胞。这些细胞的平均半衰期为48周。6例患者在输注CD4细胞4周后，中断了抗逆转录病毒治疗。

在中断期内，循环细胞中CCR5缺失的细胞数下降明显慢于无CCR5缺失的细胞。在其中1例患者中，HIV RNA甚至下降到检测线以下。在大多数患者中，血中HIV DNA水平都下降。

这是第1例在人类身上运用基因编辑技术。这项工作强烈提示我们，可以创造一个抵抗HIV感染的免疫系统。June对自己的研究成果很有信心。他们现在正在扩大样本量，并探索CCR5修饰T细胞的最佳剂量。

2、其他核酸酶的方法

与锌指核酸酶类似，其他类型的核酸酶技术也可以在人类细胞中编辑靶向基因，具有较高的特异性和较低的细胞毒性。例如，可编程的、序列特异性的DNA结合酶—类转录激活因子效应物核酸酶，简称为TALEN。在实验室中已经成功敲除CCR5基因。

另一个新的方法进行CCR5基因编辑方法叫做CRISPR。此系统的工作原理是 crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。

而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。这种方法是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。

加利福尼亚大学的Yuet Kan博士最近使用这个系统使诱导多能干细胞（iPSCs）转变为保护性CCR5基因的纯合子。从这些细胞分化而来的单核细胞和巨噬细胞可以抵抗HIV感染。

从理论上讲，基因编辑的干细胞可以在病人体内产生抗HIV的白细胞和T细胞，最终导致病人被治愈。该方法没有抗逆转录病药物的毒性，不像疫苗需要一个健康的免疫系统，具有良好的临床前景。但是目前的挑战是如何将iPSCs诱导为适合移植的造血干细胞，还有iPSCs潜在的遗传异常和致瘤性。

专家们担心使用核酸酶技术敲除CCR5基因可能也有潜在的“脱靶”效应，可能影响其他所有基因的表达。所有的核酸酶技术都有一定程度的脱靶效应。特别是高度同源DNA序列。但是目前对于任何给定的靶基因都有多种核酸酶，可以确定一种临床上安全的方法。

Picker指出，理论上通过移植患者自身经过CCR5修饰的干细胞可以达到治愈的目标。但是实际上，这种方法还是有点另人怀疑，因为干细胞移植很危险。这种方法可以在人类身上试试，可能有效。但指望该法解决HIV问题，可能不太现实。

3、联合敲除基因

研究人员也把CXCR4基因作为一种抗HIV的策略。通过药物或基因操作抑制CCR5或CXCR4的表达，只能保护细胞不受相应株HIV的感染，这有利于另一种HIV的生长。

因此，June和他的同事用锌指核酸酶同时编辑人CD4细胞中的CCR5和CXCR4基因。当这些修改后的细胞移植入人源化的小鼠，可以保护小鼠免受CCR5和CXCR4 HIV-1的感染。

虽然理论上同时敲除两种受体可能确实比单一的CCR5要强。研究人员发现，在柏林患者体内的少量HIV病毒为CXCR4型。但是这种病毒在柏林患者移植CCR5缺失的干细胞和停止服用抗逆转录病毒药物后没有出现大量复制。

研究人员最近证明这种病毒不能在缺失CCR5的细胞中复制。因此，CCR5可能不单单是一个HIV进入细胞的第二受体。

尽管CCR5是病毒在宿主内复制的重要因素，但CCR5突变不是机体抵抗HIV感染的全部。因为有许多CCR5正常的HIV感染者可以清除HIV感染。这说明其他基因也起了关键的作用。科学家们在努力地工作，以确定这些基因。

不同人群在HIV感染后的不同临床结局，通过研究他们之间的遗传差异可能会有令人难以置信的发现。然后通过基因敲除技术，可以使这些新发现转化为新的治疗措施。